结核菌素类产品的发展历程概述

结核菌素类产品的发展历程概述

都伟欣 赵爱华 王国治 卢锦标

doi：10.3969/j.issn.1000-6621.2019.10.003

基金项目:中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2019PT310024）

作者单位：102629 北京，中国食品药品检定研究院结核病疫苗室 中国医学科学院生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

通信作者：卢锦标， Email: lujinbiao@nifdc.org.cn

文章来源：都伟欣，赵爱华，王国治，等. 结核菌素类产品的发展历程概述. 中国防痨杂志，2019，41（10）：1080-1083.

【摘要】 结核菌素类产品研发至今已120多年，经历了旧结核菌素、纯蛋白衍生物和新型皮肤试验诊断试剂的不同发展阶段。本文介绍以上产品的研发历程和产品特点，以及发展趋势，供使用人员了解其背景知识，便于更合理的应用此类产品，同时也为新型皮肤试验诊断试剂的研究提供借鉴。

【关键词】 结核菌素；生物制品；结核菌素试验；评论

旧结核菌素（old tuberculin，OT）是最早应用的结核病皮肤试验的诊断试剂，问世至今已有120多年的历史。该类产品经历了从滤液浓缩粗制发展为精制结核菌素纯蛋白衍生物(tuberculin purified protein derivative，TB-PPD)阶段，迄今仍然是结核病筛查最常用的诊断试剂。进入21世纪后，具有可鉴别卡介苗接种与结核分枝杆菌感染的新型皮肤试验诊断试剂（重组结核分枝杆菌变态反应原）问世，为结核病辅助诊断揭开了新的篇章。笔者简要概述旧结核菌素、TB-PPD、卡介菌纯蛋白衍生物（BCG-PPD），以及新型皮肤试验诊断试剂的发展历史。

一、旧结核菌素的发现和应用

1882年，科赫证实结核分枝杆菌是结核病的致病菌，虽然发现了致病原因，但如何治疗肺结核又成为非常重要的研究内容。1890年，科赫将结核分枝杆菌接种于含5%甘油的牛肉汤，在37 ℃条件下经6～8周培养后，加温100 ℃约1 h后过滤，再将滤液加热80 ℃蒸发，浓缩至原来体积的1/10制成旧结核菌素，希望借助结核菌素用于结核病的治疗。但在初次试用旧结核菌素治疗时，观察到若干患者因此引起了严重的全身性或局部反应，包括发热、肌肉酸痛、呕吐等，而未接受结核菌素治疗的患者无这些反应。因此，尽管临床上的使用结果表明旧结核菌素对结核病无治疗作用，但这种超敏反应却可以作为结核病的诊断依据，并最终发展成结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）。

1907年奥地利医生Von Pirquet采用结核菌素皮肤刮种法用于结核病诊断，其后关于旧结核菌素试验的方法有了不少改进，如Moro透皮试验、Trambusti试验、Vollmer透皮试验和Mantoux试验等。在这几种方法中，Von Pirquet和Mantoux的检测方法应用最为普遍。

Von Pirquet首创的皮肤试验法是在前臂消毒过的皮肤上滴两滴旧结核菌素（间隔约10 cm），用柳叶刀先在两滴旧结核菌素中间的皮肤上做环状划痕为对照，再在两滴旧结核菌素处的浅表皮肤上同样操作制作划痕。24 h和48 h后，如果旧结核菌素导致的红色丘疹直径大于5 mm，即为阳性。该法引入挪威后，通过在结核菌素中添加1%肾上腺素，提高了Pirquet法的敏感度。Mantoux检测法是至今使用最广泛的皮内注射法。将旧结核菌素用无菌生理盐水稀释10 000倍后，在前臂肘关节下2寸（约6.7 cm）处皮内注射0.1 ml该溶液，必须使注射处产生5 mm的白色轮状突起。48～72 h后观察其反应强度，以皮肤上产生红肿的平均直径的大小来判定。

旧结核菌素生产工艺较为粗糙，主要成分为结核分枝杆菌蛋白及其分解产物，同时还包括了一些与活性无关的多糖、核酸、脂类、结核分枝杆菌代谢产物及培养基中的各种成分。1952年，世界卫生组织（WHO）将旧结核菌素标准化，规定1结核菌素单位 (tuberculin unit，TU)=1/100 mg的国际标准旧结核菌素，即1 mg旧结核菌素=100 TU，1 ml旧结核菌素=1000 mg，1 ml旧结核菌素=1000×100=100 000 TU。由于旧结核菌素皮肤试验的特异性不足，早已被TB-PPD所替代而停止使用。

二、国外TB-PPD的研制历程

旧结核菌素问世后，Long和Seibert证明其有效成分为蛋白质。1934年，Long等采用Dorset培养基制备了旧结核菌素，经超滤、过滤、三氯乙酸沉淀、离心、乙醚萃取三氯乙酸以及脱水等步骤，获得了效价、均一性和稳定性都优于OT的结核蛋白，并命名为纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）。

之后，Seibert发现用硫酸铵作沉淀可得到纯度更高的结核菌素，1939年生产了一大批PPD（批号49608）共107 g，其主要成分为约92.9%的蛋白质，5.9%的多糖和1.2%的核酸，当时作为美国结核菌素参考标准，借以鉴定各地生产的结核菌素效价。由于这批PPD纯度较高，效价和特异度更强，1952年，WHO生物标准化专家委员会将其定为哺乳类结核菌素国际标准品，并正式命名为PPD-S。PPD单位有2种，一种是“国际单位（IU）”，另一种是“TU”。其中1 IU相当于0.028 μg PPD-S（包含0.02 μg PPD和0.008 μg盐）的生物活性。在美国和加拿大，PPD的效价单位表示为TU，1 TU相当于0.02 μg PPD-S的生物活性。

国际上临床使用量最大的PPD制品是丹麦血清学研究所（SSI）制备的，该研究所于1941年相继制成了PPD-RT19、PPD-RT20、PPD-RT21、PPD-RT22等几批PPD制品。20世纪50年代，该研究所受WHO与联合国国际儿童基金会的委托生产了一大批PPD，定名为PPD-RT23。WHO推荐各国将PPD-RT23用于结核病流行病学调查。PPD-RT23是以7株人型结核分枝杆菌所制成，其中E5、E9656、E1580和U1921是制备RT19-22的原菌株，新增加的3株——T3419、T3480、T3487均为从结核病患者中分离出来的菌株。SSI共制备了95批滤液，其中18批发现有沉淀而废弃，保留了77批，用乙醚制成混悬液，挥发干燥，保证了混合的均匀，提高了蛋白纯度。在PPD-RT23的标化过程中，添加吐温-80后可降低容器对PPD的吸附，从而提高其效价，最终标定1单位PPD-RT23为0.02 μg，其生物活性相当于0.06 μg（3单位）的PPD-S。SSI共制备了670.5 g干重的PPD-RT23，复溶的原液用含0.01%羟基硫酸喹啉(防腐剂)和0.005%吐温-80（稳定剂）的磷酸缓冲液（pH 7.38）稀释成成品，估计可满足全球十年使用量。

三、国内TB-PPD产品的研制历程

TB-PPD的国产化研究起始于20世纪70年代末，中国药品生物制品检定所的科学工作者在总结国外的酸变性沉淀法和盐析法的优点基础上进行改进，建立了酸变性加盐析的PPD综合制备方法，以此方法研制出了TB-PPD和我国独有的BCG-PPD。并将1980年制备的批号为80-1的TB-PPD和BCG-PPD冻干制剂作为我国PPD参考品。我国PPD参考品的纯度与活性各项指标均达到了WHO关于结核菌素制品相关规程的要求。

我国建立的PPD生产工艺与国外生产工艺不尽相同，国外PPD-RT23和PPD-S的生产工艺均为单一沉淀法。PPD-RT23制品采用的是三氯醋酸沉淀法，PPD-S制品采用的是硫酸铵盐析法。三氯醋酸沉淀法无法彻底去除多糖与核酸，导致PPD-RT23制品杂质含量相对偏高。硫酸铵盐析法的缺点是产量低。国产TB-PPD和BCG-PPD生产工艺均采用的是双酸沉淀法和冷冻干燥技术，即保证了产量，又能有效控制杂质含量。即首先应用终浓度2%三氯醋酸沉淀蛋白，加压过滤后去除上清，蛋白沉淀以磷酸盐缓冲液溶解后，以硫酸铵法再沉淀蛋白，并收集蛋白于3 μm孔径滤膜上以10%氯化钠脱盐至中性，加入适量防腐剂，以磷酸盐缓冲液溶解，除菌过滤后冷冻干燥制成。同时我国PPD产品中均加入吐温-80表面活性剂，有效避免了蛋白吸附，极大提高了PPD产品的稳定性，延长了有效期。

目前，国内TB-PPD制品有2个规格，分别为2 IU和5 IU。BCG-PPD制品仅有1个规格，即5 IU。我国TB-PPD与BCG-PPD均采用国际TB-PPD 标准品PPD-S为标准基础进行标化，5 IU BCG-PPD与相同剂量5 IU TB-PPD的效价与反应强度基本一致。如薛平等在临床上进行BCG-PPD和TB-PPD的同体双臂皮肤试验，结果显示BCG-PPD与TB-PPD在5 IU相同剂量下，卡介苗接种后阳转率与结核分枝杆菌感染者检测结果阳性率基本一致，但反应强度略有差异。二者的使用说明书内容也基本一致，主要用途为“供结核病的临床诊断、卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后的质量监测用”。

国内2 IU TB-PPD的用途为“专供结核病流行病学调查及临床疑似结核病患者诊断用”。2 IU和5 IU TB-PPD来自生产工艺相同的相同原液，且分别采用与其剂量对等的国家参考品进行标化，因此，一般2 IU TB-PPD的皮肤试验反应强度会低于5 IU 产品。如苏城等进行的动物试验结果显示：2 IU TB-PPD诱导的皮肤试验反应强度小于5 IU。

因国内存在着不同类型和不同剂量PPD产品，有些研究会采用不同剂量PPD产品进行对比研究。但在采用不同剂量产品的研究中，剂量对皮肤试验反应结果的影响会大于不同类型制品的影响。由于TB-PPD与BCG-PPD均采用国际标准品PPD-S为标准基础进行标化，效价差异不大；因此，阳性率与皮肤试验反应（硬结平均直径的大小）的差异主要由剂量差异引起，不同类型差异造成的影响较低。目前，以2 IU TB-PPD和5 IU TB-PPD或BCG-PPD进行同体双臂大样本研究的极少，非同体双臂而样本量较大的有孟炜丽等的研究，该研究回顾性分析了2012—2013年北京市西城区3所大学5 IU BCG-PPD与2 IU TB-PPD两组学生皮试反应结果，其中5 IU BCG-PPD组的阳性率为54.8％（759/1386），明显高于2 IU TB-PPD组的32.7％（469/1435）。该结果也证实了PPD制品的剂量越高则阳性率越高。

四、新型皮肤试验诊断试剂的研究

虽然结核菌素试验是世界各国筛选结核分枝杆菌潜伏感染者的重要方法，但该试验仍具有一定的缺陷性。由于结核菌素试验所依赖的PPD制品含有200多种抗原，并且大多数抗原为分枝杆菌属所共有，因此在鉴别结核分枝杆菌感染与非结核分枝杆菌感染的特异性较差，并无法区分卡介苗接种阳性者与结核分枝杆菌感染者。因此，新颖的和更有效的皮肤试验诊断试剂是当前研究热点，主要是寻找和制备特异性强的结核分枝杆菌抗原，以单一抗原或组合抗原来制备新的皮试试剂。目前，研究较多的为早期分泌抗原靶6（ESAT6）、培养滤液蛋白10（CFP10）、MPT64等卡介苗丢失而结核分枝杆菌依然保有的抗原，其中有些抗原已经完成人体临床试验。比如国内的重组结核分枝杆菌ESAT6-CFP10变态反应原（简称EC），是由ESAT6、CFP10蛋白融合表达，纯化制备而成。EC作为新型皮肤试验诊断试剂，较PPD制品的特异性强，可区分卡介苗接种和结核分枝杆菌感染。目前，EC制品已完成Ⅲ期临床研究。通过对EC用于结核病临床辅助诊断、结核潜伏感染者筛查、结核感染与卡介苗接种者的鉴别等系统研究，证实该重组变态反应原安全、有效。EC现已经申报一类治疗用新生物制品，生产注册申请已被国家新药审评中心正式受理（CXS1800022）。该制品将成为新一代极具潜力与市场前景的结核潜伏感染人群筛查和结核病辅助诊断的皮试试剂。

五、小结

结核菌素类产品历史悠久，经过百余年的发展，随着新型皮肤试验诊断试剂的问世，该类产品的应用将面临新的变革。由于PPD与新型皮肤试验诊断试剂特点各异，互相不能完全取代，在以后的实际使用中，应根据产品特点选择更优的使用方案。如在卡介苗接种者阳转考察及成人接种或补种卡介苗前的筛查试验中可单独使用PPD产品。在结核病流行病学调查、结核病辅助诊断、结核潜伏感染人群筛查等方面可单独使用EC产品。而PPD和EC联用将主要用于结核感染与卡介苗接种者的鉴别诊断，以及结核病高风险人群全人群预防免疫接种前的筛查等方面。